Biocontrol capability of bacteriophages against soft rot disease caused by Dickeya chrysanthemi

Aims@#This study aims to evaluate the effectiveness of bacteriophages isolated from Klang and Penang, Malaysia against Dickeya chrysanthemi that causes soft rot disease.@*Methodology and results@#Basic characterization such as dextrose test, citrate test, lactose fermentation test and ornithine test were carried out on D. chrysanthemi. Activity of bacteriophages against D. chrysanthemi was evaluated using spot test. Double agar overlay assay was performed to purify and enumerate the quantify of bacteriophages.Bacteriophages were also checked for its effectiveness in controlling soft rot on post-harvested vegetables: potato (Solanum tuberosum), cucumber (Cucumis sativus) and apple (Malus domestica). Results showed that D. chrysanthemiable to utilize citrate and dextrose as the source of energy, which indicated that D. chrysanthemi inclined to choose fruits and vegetables containing citrate and dextrose as the target of attack. Clear zone observed on the bacterial lawn (spot test) indicated the ability of the bacteriophages to infect and lyse D. chrysanthemi. All the bacteriophages studied herein reached the highest concentration on day 3 and were monovalent.@*Conclusion, significance and impact of study@#All the isolated bacteriophages were able to restrain the spreading of soft rot caused by D. chrysanthemi either work alone or as cocktail. This study provides information for the formulation development of bacteriophage against soft rot disease cause by D. chrysanthemi. Furthermore, this study reveals the potential of locally isolated bacteriophages against the D. chrysanthemi and paving the application of phage treatment on agriculture products that are not limited to potatoes, cucumber and apple.

L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi: expressão proteica livre de células e bioconjugação a bacteriófagos / L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi: cell-free protein expression and bioconjugation to bacteriophages

A L-Asparaginase (L-ASNase) de Erwinia chrysathemi (ErA) é uma enzima amplamente utilizada para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). Embora o seu uso como segunda linha de tratamento para a LLA tenha proporcionado consideráveis benefícios clínicos, reações de hipersensibilidade e rápida depuração plasmática ainda são problemas recorrentes. Ademais, extensivos e custosos processos de produção da ErA são necessários para a obtenção da enzima pura. Com base nesses problemas, o presente trabalho propõe (1) o estudo de viabilidade de expressão da ErA em um sistema de síntese proteica livre de células (SPLC) e (2) a conjugação da proteína em bacteriófagos como ferramenta alternativa para o isolamento e monitoramento da depuração plasmática da ErA. Foram utilizados extratos celulares de Escherichia coli suplementados com solução energética contendo creatina fosfato (CP) como fonte de energia para síntese in vitro de ErA. Para conjugação da ErA a bacteriófagos, o sistema SpyTag/SpyCatcher foi implementado: SpyCatcher foi fusionado à porção N-terminal da ErA e bacteriófagos filamentosos da linhagem M13 e fd foram modificados de modo a expressar SpyTag nas proteínas de capsídeo pIII e pVIII, respectivamente. Em relação ao primeiro objetivo, o sistema de SPLC foi capaz de expressar a ErA com atividade. A proteína foi expressa na fração solúvel e apresentou atividade enzimática significativamente superior em relação à reação controle (7,07 ± 0,68 U/mL vs. 1,83 ± 0,14 U/mL). Tempo necessário para obtenção do extrato celular foi reduzido de 45 para 26 hrs, e sete componentes da solução energética foram removidos da composição original sem implicações negativas na eficiência de expressão da ErA, simplificando desta forma o processo de SPLC. Em relação ao segundo objetivo, ErA fusionada à SpyCatcher (SpyCatcher_ErA) foi conjugada com êxito em bacteriófagos capazes de expressar SpyTag fusionadas na porção N-terminal das proteínas pIII (SpyTag_pIII) e pVIII (SpyTag_pVIII). A porcentagem de formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pIII ((ErA)5-pIII) foi de 6% enquanto formação dos conjugados entre SpyCatcher_ErA e SpyTag_pVIII ((ErA)50-pVIII) foi de 46%, valores estes confirmados por atividade enzimática. Solução contendo conjugados foram injetados em camundongos e sequenciados/titulados com êxito. Não houve diferença de depuração plasmática entre (ErA)5-pIII e bacteriófago controle, mas houve maior taxa de eliminação de (ErA)50-pVIII em relação ao mesmo bacteriófago não conjugado à SpyCatcher_ErA. Os resultados aqui apresentados confirmam ser possível expressar ErA com atividade biológica em sistemas de SPLC. Além disso, o sistema de conjugação da ErA a bacteriófagos aqui desenvolvido foi capaz de monitorar a concentração de ErA presente na circulação em função do tempo, tornando-se uma potencial plataforma de desenvolvimento de novas proteoformas da ErA com características clínicas melhoradas

L-Asparaginase (L-ASNase) from Erwinia chrysanthemi (ErA) is a widely used enzyme for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Although its use as a second-line treatment has provided significant clinical benefits, hypersensitivity reactions and a fast clearance rate are recurring L-ASNase-related problems. In addition, extensive and costly production processes are required for the manufacturing of pure ErA. Based on these drawbacks, this current work proposes (1) the study of the use of a cell-free protein synthesis (CFPS) system as a viable platform for the synthesis of ErA and (2) the conjugation of the protein on bacteriophages as an alternative tool for the isolation and monitoring of ErA clearance. Escherichia coli-derived cell extracts supplemented with a creatine phosphate-based energy solution were used to synthesize ErA in vitro. To conjugate ErA on bacteriophages, the SpyTag/SpyCatcher system was implemented: SpyCatcher was fused to the N-terminus of the ErA while filamentous phage strains M13 and fd were engineered in order to display SpyTag on their pIII and pVIII capsid proteins, respectively. Regarding the first goal, the CFPS system was able to express an active ErA. The protein was expressed in the soluble fraction and there presented a significant higher enzymatic activity compared to the control reaction (7.07 ± 0.68 U/mL vs. 1.83 ± 0.14 U/mL). Time required to obtain the cell extract was reduced from 45 to 26 hours, and seven energy solution reagents were removed from the original solution without compromising the efficiency of ErA expression, thus simplifying the CFPS process. With respect to the second goal, ErA fused to SpyCatcher (SpyCatcher_ErA) was sucessfully conjugated on bacteriophages capable of displaying SpyTag fused to the Nterminus of the pIII (SpyTag_pIII) or pVIII (SpyTag_pVIII) proteins. Percentage of conjugate formation between SpyCatcher_ErA and SpyTag_pIII (ErA)5-pIII was 6% whereas conjugate formation between SpyCatcher_ErA and SpyTag_pVIII (ErA)50-pVIII was 46%, values that were confirmed by enzymatic activity. Sample containing conjugates were injected into mice and sucessfully sequenced/titrated. No clearance differences were observed between (ErA)5- pIII and a control bacteriophage, but a higher clearance rate was observed for (ErA)50-pVIII compared to SpyTag_VIII non conjugated to SpyCatcher_ErA. The results here presented confirm the expression of a biologically active ErA from a CFPS system. Besides, the development of a conjugation system capable of linking ErA to bacteriophages could be used as a means to monitor the ErA concentration in the blood as a function of time and also as a potential platform to be used in the development of novel ErA proteoforms with improved clinical properties

Caracterização de L-Asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteí­nas e otimização das condições de produção / Characterization of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase improved by synthetic protein evolution and optimization of production conditions

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante

L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase

Efeitos de osmólitos na L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi em meio aquoso / Effects of omolytes in L- asparaginase II from Erwinia chrysanthemi in aqueous medium

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes.

L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

Isolation of Dickeya dadantii strains from potato disease and biocontrol by their bacteriophages

One of the most economically important bacterial pathogens of plants and plant products is Dickeya dadantii. This bacterium causes soft rot disease in tubers and other parts of the potato and other plants of the Solanaceae family. The application of restricted host range bacteriophages as biocontrol agents has recently gained widespread interest. This study purposed to isolate the infectious agent of the potato and evaluate its biocontrol by bacteriophages. Two phytopathogenic strains were isolated from infected potatoes, identified based on biochemical and 16S rRNA gene sequencing, and submitted to GenBank as D. dadantii strain pis3 (accession no. HQ423668) and D. dadantii strain sip4 (accession no. HQ423669). Their bacteriophages were isolated from Caspian Sea water by enriching the water filtrate with D. dadantii strains as hosts using spot or overlay methods. On the basis of morphotypes, the isolated bacteriophages were identified as members of the Myoviridae and Siphoviridae families and could inhibit the growth of antibiotic resistant D. dadantii strains in culture medium. Moreover, in Dickeya infected plants treated with bacteriophage, no disease progression was detected. No significant difference was seen between phage-treated and control plants. Thus, isolated bacteriophages can be suggested for the biocontrol of plant disease caused by Dickeya strains.